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            操作保養

            • 高效液相色譜儀操作三要點(中)
            高效液相色譜儀操作三要點(中)

            二、過濾

                 任何顆粒物進入HPLC系統后都會在柱子入口端被篩板擋住,最后的結果是將柱子堵塞,表現出的特征是系統壓力增加并使色譜峰變形。因此,要采取各種預防措施,包括操作步驟和商品儀器自身的各種過濾設計,努力防止或減少顆粒物進入HPLC系統中,從而延長儀器和色譜柱的使用壽命,并提高數據的可靠性。在HPLC系統中,顆粒物的主要來源有三個途徑:流動相、被測樣品和儀器系統部件的磨損物。

            1、流動相

                 如果流動相均由高效液相色譜級溶劑組成,流動相沒有必要過濾。這是因為高效液相色譜級的有機溶劑,例如乙腈、甲醇等,在制造的工藝過程中都已經過了0.2 μm微孔濾膜過濾。同樣的,無論你是買的HPLC級的水還是在實驗室使用超純水凈化系統制備的水,最后一步也是通過0.2 μm微孔濾膜。然而,如果有任何一種緩沖液中加入了固體物,例如磷酸鹽,流動相過濾將是必要的一個步驟。雖然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的,但它還是可能含有顆粒物質,例如在蓋試劑瓶的塑料內蓋時,塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就會產生塑料顆粒。在這種情況下,添加的一種固體物可能完全溶解了,但是少量雜質顆粒存在于流動相中成為殘渣。

                 流動相通過0.45 μm微孔濾膜過濾對于從流動相中除去所有顆粒物是一個有效方法。0.2 μm微孔濾膜也可以用,但是它們就這個應用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效,而且它的過濾速度會更慢,特別是當實驗室使用的試劑和水的質量不太好時。建議實驗室在編寫制定他們流動相制備標準操作程序(SOPs)時規定,可以借鑒國際上同類實驗室的規定,即:

                 流動相制備僅采用HPLC級液體時不需要過濾,反之所有流動相組成在使用前必須過濾。

                 在連接儲液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過濾器(常見材質有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種)也是很重要的。這個過濾器的規格為≥10 μm的微孔物質,所以它不能取代流動相過濾步驟,但是它能除去系統中的塵土并保證儲液瓶、輸液管使用的可靠性。


            2、被測樣品

                 液相系統中的第二個顆粒物來源是被測樣品。一些實驗室在將他們的樣品放置在自動進樣器盤(或手動進樣)以前,所有樣品都先通過一個0.45 μm針筒式過濾器過濾。這是一個有效除去被測樣品中顆粒物的方法。但是這個過程也有一點需要關注:你使用了針筒式過濾器就不可能100%得到通過過濾器的被測樣品,總會有或多或少的丟失。丟失來自這樣幾方面:過濾器濾膜的吸附、過濾器濾出的顆粒物上的吸附、針筒式濾膜過濾器與針筒連接處的滲漏等。如果有丟失,過濾后液體中被測物的含量或濃度與原基本樣液的含量或濃度還相同嗎?這個問題一般需要通過實驗確認。確認這步是要增加工作量和費用的。過濾器的使用是一種消耗,每個過濾器的價格從幾元到十幾元。但在做食品中殘留物分析時,由于基質大多比較復雜,所以過濾這步已成為不可或缺的一步。在實際分析工作中,一般檢測每一組樣品會帶一個外標、一個添加回收或是質控樣品,所以,只要最終檢測時得到的信噪比能滿足檢出限要求,可將這步視為系統誤差而忽略。


            3、儀器系統部件的磨損物

                 最后,在HPLC系統中顆粒物的另一個主要來源是輸液泵密封墊和進樣閥旋轉軸的磨損。關于輸液泵密封墊的磨損更換有兩種不同建議。

                 第一種建議認為,在一般實驗室中輸液泵密封墊通常使用壽命為六個月到一年,因此建議半年或一年更換這些密封墊,實驗室應基于上述觀點制定定期預防性維護計劃。該觀點認為:與輸液泵密封墊顆粒堵塞柱子而更換新柱子的費用相比,更換密封墊的費用低些。一些輸液泵有玻璃砂芯或篩網,可在流路中濾掉從泵密封墊磨損下來的顆粒物,防止這些顆粒物隨流動相流至柱頭。若有這種裝置應查閱輸液泵操作手冊,查看推薦的這種過濾器清洗或更換的間隔。

                 另一種建議則認為,原裝密封墊的密封效果最好,更換以后容易引起流動相滲漏。所以,只要不漏液就不要輕易更換密封墊。

                 兩種說法都有其道理,具體如何操作,建議與儀器公司工程師溝通,各公司的儀器還是有些不同的。

                 自動進樣器旋轉軸的密封隨著使用時間也會磨損,但是在我的經驗中,即便是高負荷的運轉旋轉軸密封墊也可以使用幾年。如果你的自動進樣器系統有計數進樣閥轉動次數的功能,你可以設定一個警鈴當預設閥轉動次數已達到時提醒你。曾有一種說法,進樣器最多轉動20,000次,這僅僅是進樣10000個;但這似乎不是實驗室涉及的常規樣品分析使用壽命,它們的實際使用壽命會更長。旋轉軸密封磨損后會滲液,比較明顯的特征是同一樣品多次進樣后,峰面積值差別比較大(RSD>5%)。當然,輸液泵的密封墊和旋轉軸的密封墊磨損將增加更多研磨物在流動相中,加速對這些部件的損傷。此外,如果你日常運行的流動相有緩沖鹽,如磷酸緩沖鹽,密封墊的磨損會更快。

                無論顆粒物源于何物,實驗時都要將其除去。推薦在HPLC系統中采用一個0.45或0.5 μm的在線多孔過濾器,接在自動進樣器和柱子之間,即使已使用了保護柱。這個在線過濾器將成為擋板代替柱頭的濾板,而且如采用一個玻璃砂芯濾板,既便宜,更換又方便(幾分鐘就可更換)。若采用在線過濾,HPLC系統檢測每批樣品開始前記錄下壓力值,當壓力上升一定值,例如25%或增加500psi,應該更換玻璃砂芯濾板了,更換以后沖洗幾分鐘系統將恢復到原來的壓力值。


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