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            液相色譜柱使用16大問題大解析

            1.對于一根常用的C18柱,拿到一根新柱的時候應該怎樣進行活化及維護?為什么要這樣做?

            答:新柱活化,實際上是一個平衡的過程,除了用流動相平衡外,有時候還必須用所測樣品對新柱進行平衡,特別是測定分子量比較高的多肽,尤其重要。因為分子量高的物質分子,擴散速度慢,平衡所需時間也相應較長。具體平衡方式也很簡單,多進幾次樣品,直到峰面積和保留時間穩定,再進行正式進樣測定。
            如果要加快平衡時間,把前面用來平衡的進樣樣品濃度加大,或者不等洗脫完成,連續進樣多針。用待測物對新柱平衡,目的是將硅膠基質填料表面具有非特異性吸附的位點的吸附能力飽和掉。


            2.測定多肽,一般采用什么柱子?流動相是乙腈和水,還有微量的TFA。特別是像類似三肽的短肽,應該怎么選擇柱子?
            答:分子量不高的多肽一般選用常規C18柱就能測定,也有用離子交換柱、水性C18柱和Hilic親水作用柱的。


            3.氨基柱在進酸性樣品時,很傷柱子,如使用一段時間后,柱效降低,峰形改變,如何恢復?
            答:氨基柱測酸性樣品,應該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會使略帶負電荷的氨基官能團質子化,導致使用一段時間后對于某些類的分析物保留性質有所改變或表現在柱效下降。建議:用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當然要再用不含堿的流動相洗去多余氨),之后再進行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1%。

            4.色譜柱的技術都有哪些?比如封尾等,這些技術在應用時都體現在哪里?
            答:色譜柱技術包括填料技術和裝柱技術,填料技術自不待言,填料的好壞對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術也沒有想象中的這么簡單,不同固定相、不同粒徑、不同柱管內徑和長度,裝柱工藝都有所不同,要裝出緊密、穩定、均一的柱床,更多是一門藝術,需要經驗積累。
            國內和國外想比,我認為色譜柱的差距在于:國內公司以前都不會自己開發填料,一般買國外現成填料裝柱,買到的填料質量控制權不在自己手里。另外因為裝柱歷史短,經驗積累少,裝柱工藝也沒有完全達到國外水平。另外,對色譜柱性能很關鍵的基礎材料-----裸硅膠,國產的還不過關,在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國外產品相比,差距很大。


            5.色譜柱技術的差距在哪里?
            答:液相色譜柱裝填實際上是有一定技巧和程序,可能還有一些運氣。一般使用 高壓勻漿方法裝填。也就是能讓填料在溶劑內均勻地懸浮。然后用瞬間高壓壓實,這實際上用到了不同比例的勻漿液體,和合適的壓力。壓力太大,顆粒破碎,壓力太小,塔板數少。同時壓力需要穩定,不然分布不均,拖尾嚴重。同時還有頭上平整程度。套上套,就可以用了。


            6.柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢?原來也討論過這個問題,我也拆下來清洗過,但我看到柱前段的污染更甚,于是就用刀片刮了刮,然后把清洗好的篩板安裝上去。問題解決了,但使用壽命會不會減少呢?
            答:柱頭污染了,就取出污染的,再裝一些填料。因為加入你刮了些填料,那么微觀的塔板數就少了。假入你刮得不多,僅表面,可能就是一些臟物,所以,問題解決。但是今后還會有同樣問題,再掛,那么不小心刮,影響柱效。建議還是裝一個預柱。


            7.如果柱子取下來放置一段時間,需要做什么保護嗎?
            答:對一般的反相柱,也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中,然后用堵頭塞緊柱兩頭,以免保存溶劑揮發,應該不需要做特殊的保護。


            8.流動相中加入適量的四氫呋喃可以改善峰形的機理是什么?
            答:《高效液相色譜方法及應用》于世林編著的上面說:甲醇為質子給予體、乙腈為質子接受體、四氫呋喃是偶極溶劑,應該除了極性影響,還有另外的影響因素,至于分離機理,還是比較復雜的,不能看成是個萬能方法。


            9.關于色譜柱的填裝問題!我個人認為現在色譜柱的填裝一般有3種情況:

            (1)國外生產填料并填裝完成成品賣到國內;

            (2)國外生產填料,國內填裝銷售;

            (3)國內生產填料,國內填裝銷售。

            一般情況下,第1種情況賣的最貴,也質量最好!可是我就不明白了:如果是填料的生產很復雜的話,那么填裝上國內也跟不上去嗎?為什么換在國內填裝就會出現或多或少的一些小問題呢?
            答: 國內填裝會出現質量小問題,和國內目前普遍做事沒有國外嚴謹有關吧。如果工藝技術上沒有問題,又能制訂并切實執行一整套嚴格的生產質量管理措施,國內填裝和國外填裝并無區別。


            10.國產色譜柱在市場上占有比例如何???
            國內色譜柱市場還沒有人進行過科學統計,連一年色譜柱銷售總量也眾說紛云,更別說國內生產色譜柱所占份額了。我估計是占30%左右吧。


            11.預柱或保護柱用還是不用的問題!原來分析中藥品種時,我一直都是用保護柱。但來到新公司后,發現大家都沒有使用,幾個實驗室連保護柱都沒找到一個,也就是說大家從來都沒有用過。后來問一個老員工,說是有可能影響藥品分析。我就想問:安裝保護柱后會影響樣品分析嗎?我們做的大多是頭孢類的抗生素。
            答:應該這樣說,加上保護柱,肯定有利于保護色譜柱不受一些顆粒物質的堵塞,肯定有害于分離度和柱效,因為保護柱中間有著死體積的存在
            但是如果保護柱接得好,并且盡量控制其匹配性和經常更換,分離度和柱效應該影響并不大。
            頭孢類的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍,有些原料藥,可以根據色譜柱的損耗選擇添加預柱(中間是個篩板),制劑的話,如果有輔料嚴重干擾或者流動相鹽分比較大,那還是最好配個保護柱。


            12.用的是四元梯度泵A50% 甲醇 B50%水  經常出現?;蜻M氣泡這是什么原因?
            答:水/甲醇比例在55:45時,黏度和柱壓有個極大值。50:50接近了這個極值,柱壓是比較高的,但影響柱壓最大的還是填料粒徑和色譜柱內徑,你這個實例中不知用的什么規格的色譜柱?系統壓力高,可能會因溶劑泵中的過濾頭供液速度跟不上而導致氣泡進入系統,停機也應該是因為氣泡進入壓力下降的原因,可考慮更換液體通量更大的過濾頭。


            13.資料顯示:在正常條件下,填料粒度>20μm時,干法填充制備柱較為合適;顆粒<20μm時,濕法填充較為理想。填充方法一般有4種

            ①高壓勻漿法,多用于分析柱和小規模制備柱的填充;

            ②徑向加壓法,Waters專利;

            ③軸向加壓法,主要用于裝填大直徑柱;

            ④干法。柱填充的技術性很強,大多數實驗室使用已填充好的商品柱。為什么以20um為分界點?填料方法的前三種都是濕法嗎,能不能對四種填充方法做一個簡短的說明?


            14.想請您具體說明一下反沖色譜柱的方法,是不連檢測器嗎?
            答:反沖就是將柱子反向連到系統中。因為有污染物反沖出來,當然不連檢測器,出液端直接接到廢液瓶就可以。


            15.網上對柱子是否可以反沖一直有爭論,那什么樣的柱子可以反沖,什么不可以。反沖后是正者用,還是反著用。具體到各型號柱子不僅是ODS柱,其他如正向柱、氨基柱、離子交換柱等最好都有解釋。
            答:一般的正相反相柱應該都能反沖,只有兩端篩板孔徑不對稱的柱子不能反沖,不過目前這樣的柱子已經比較少見了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉,反沖后還是正著用比較好,以免柱子的兩頭都被污染。我們一直提倡的是:正向使用,反向沖洗。


            16.我在做方法開發的時候,用乙腈和水作為流動相,在調整梯度的時候發現,剛開始用60%乙腈, RT為2.5分鐘,調到40%乙腈,RT沒有變化,30%也沒有變化,一直調到20%的時候,RT突然變到了約13分鐘,請問這是什么原因?我用的是離子交換柱。
            答:離子交換柱的保留時間主要由洗脫液的離子強度和pH決定,你現在講的比較簡單,需要把你的方法說的詳細一點才能做具體的分析。譬如分析物是什么情況,其含有極性電離基團和非極性基團是什么性質?離子交換柱是聚合物基質還是硅膠基質?水相是什么緩沖鹽?


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